植物病毒病檢測方法

植物病毒病是農業(yè)生產上一種重要病害，嚴重影響農作物的產量和質量, 目前還沒有1種治療效果較理想的藥劑，對發(fā)病植株做到早期診斷及提前檢測就顯得尤為重要。植物病毒學歷經近百年的發(fā)展，植物病毒的檢測方法與手段也在不斷發(fā)展與改進。常用的方法有侵染力測定法、血清學方法、電子顯微鏡計數(shù)和分子生物學法等。

1.4.1侵染力測定法

侵染力測定法是將病毒樣本接種在植物上，根據侵染力的大小定量。它的靈敏度在所有定量法中是比較高的，而且是其他定量法的基礎。設計一種新的定量法，如果不經過侵染力的驗證，將無法判斷測定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力測定法包括局部枯斑法、淀粉－碘斑法、系統(tǒng)感染率的測定法等。侵染力測定多用粗汁液來接種，為了避免抑制物質的作用和使半葉枯斑數(shù)目控制在一定范圍，須用緩沖液稀釋接種物。

局部枯斑法 1929年F.O.Holmes發(fā)現(xiàn)TMV在心葉煙（Nicotiana glutinosa）接種葉片上引起局部壞死斑點，在一定的病毒濃度范圍內，所產生的斑點數(shù)目與病毒濃度成正比例。這一發(fā)現(xiàn)成為病毒侵染性定量測定的基礎（田波，1987）。所有機械傳染的病毒都有可能應用局部斑點法，但實際上只有少數(shù)病毒具有可用于定量測定的局部斑寄主。一個待測樣品所形成的斑點數(shù)目除取決于接種物中病毒濃度外，還受試驗植物種類、環(huán)境條件和接種物中是否含有病毒抑制物質的影響。

淀粉－碘斑法 當所研究的病毒沒有過敏性枯斑寄主時，采用此法。Holmes（1931）發(fā)現(xiàn)TMV接種的煙葉上有時形成明顯的黃化斑塊，但不能用于計數(shù)。將這種接種葉用95％乙醇加熱到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色時，則侵染點處出現(xiàn)淀粉－碘的藍色反應。當下午采摘葉片，褪色過夜，然后用碘液染色，則侵染點較周圍組織著色淺；當采摘葉片前，植株先在黑暗中放幾個小時，再用碘液染色，則侵染點組織著色深。這是由于病毒侵染既降低光合組織中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物從光合組織中的運出。淀粉－碘染色的強弱受環(huán)境條件的影響較大，不如局部枯斑法可靠，但在標準化條件下仍可用于侵染性的定量測定。

侵染性滴度法 當上述方法都不適用時，可采用侵染性滴度法。即把欲測定樣品用緩沖液稀釋，可用十倍稀釋、成倍稀釋、半倍稀釋或更低稀釋。這種方法的缺點是需用大量實驗植物，但可得到較好的結果。此方法可用于介體傳染的病毒。

1.4.2血清學方法

血清學方法原理是利用抗原抗體的體外特異性結合檢測植物病毒。主要包括沉淀反應、凝聚反應、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫電鏡（IEM）、放射免疫測定（RIA）、PCR（聚合酶蓮式反應）法等。

沉淀反應 將可溶性抗原與相應的抗體混合，當兩者的比例合適，并有鹽類存在時，即有沉淀物出現(xiàn)，叫做沉淀反應。由于沉淀物主要是由抗體球蛋白所組成，為了保證有足夠的抗體，因此試驗時通常要稀釋抗原，不稀釋抗體。

凝聚反應 在微生物細胞懸液中，加入含有特異性抗體的血清，有一定濃度的電解質，微生物細胞凝聚成團，叫做凝聚反應。分為直接凝聚反應與間接凝聚反應。由于病毒是可溶性抗原，必須把病毒的抗體先吸附于一種與免疫無關的顆粒表面，然后與相應的抗原結合反應。用于吸附抗體的顆粒有皂土、乳膠、炭末、紅細胞等。

酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked Immunosorbent assay，簡稱ELISA）將酶標記物同抗原抗體復合物的免疫反應與酶的催化放大作用相結合,既保持了酶催化反應的敏感性,又保持了抗原抗體反應的特異性,因而極大的提高了靈敏度；同時它又是一種非均相分析過程,即在反應中的每一步之后都有洗滌過程,從而排除了未反應物質的干擾。自1976年 Voller和Clark等將ELISA應用于植物病毒檢測,已形成多種測試方法。常用的方法有有細胞直接法、細胞間接法、競爭法、酶抗酶法、雙夾心法（Double sandwich method）、雙抗體夾心法（Double antibody sandwich method）測定方式（侯義龍,2000）。這種方法的靈敏度高（可測出1－10納克/毫升的濃度），特異性強，操作簡便，已廣泛應用于病毒測定和診斷（盛樹力，1978；馬德芳等,1981）。

免疫電鏡（IEM）是用電鏡檢測抗體特異性結合于抗原的技術。Anderson等（1961）和Lafferty與Oeris（1961）發(fā)展了這一方法。其靈敏度高于ELISA。

放射免疫測定（RIA）在抗原抗體反應體系中，當同位素標記抗原（Ag*）與有*的抗體相互作用時，形成有標記抗原的復合物（Ag*Ab）。如下式所示：

Ag*＋Ab Ag*Ab

Ag AgAb

1.4.3 電子顯微鏡計數(shù)

本世紀三十年代初電子顯微鏡的發(fā)明，使我們能夠觀察到病毒的分子及其細微結構。1940年Kausche和Melcher在電子顯微鏡下觀察到煙草花葉病毒的顆粒。電鏡技術的建立對病毒學的發(fā)展起了巨大的推動作用。

在實際生產過程中，根據病毒的種類與特點的不同，往往需要把幾種方法結合起來，就可望建立一套快速、靈敏、準確、的水體植物病毒的檢測方法。

1.4.4.分子生物學法

分子生物學檢測法能夠檢測病毒的侵染能力。此方法靈敏度zui高，能檢測到pg級甚至fg級[1ｆｇ（飛克）=1×10-15ｇ]的病毒,特異性強，檢測速度快，操作簡便，可用于大量樣品的檢測（侯義龍,2000）。目前,常用的分子生物學方法有核酸分子雜交技術、dsRNA電泳技術、多聚酶鏈式反應技術等。侯義龍.果樹主要病毒RT-PCR檢測體系的建立、優(yōu)化及病毒特異DNA片段克隆測序研究.[博士學位論文].沈陽:沈陽農業(yè)大學,2000.6

核酸分子雜交技術 具有一定同源性的2條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫度及離子強度等）可按堿基互補原則退火形成雙鏈。此雜交過程是高度特異性的。雜交的雙方是使用的探針和要檢測—的核酸。待測核酸可以是克隆的基因片段,也可以是未克隆化的基因組DNA和細胞總RNA。根據使用的方法,被檢測核酸可以是提純的（膜上印跡雜交或液相雜交）,也可以在細胞內雜交（細胞原位雜交） （盧圣棟，1999）。

雙鏈RNA（dsDNA）電泳技術 ssRNA病毒在植物體內增殖,通過核酸互補而形成一種健康植物沒有的堿基配對dsRNA。DsRNA經提純、電泳、染色后,在凝膠上所顯示的譜帶可以反映每種病毒組群的特異性,并且有些單個病毒的dsRNA在電泳圖譜上也顯示一定的特征。因此,利用病毒dsRNA的電泳圖譜可以檢測出病毒的類型和種類（董穎蘋,2001；李鵬翔，2000）。此法已用于一些病毒組（如黃化病毒組、馬鈴薯Y病毒組、番石竹潛病毒組、煙草壞死病毒組、黃瓜花葉病毒組、絨毛煙斑駁病毒組）的分類研究。

多聚酶鏈式反應（polymerasechainreaction,PCR）技術 是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，是近10年來發(fā)展和普及zui迅速的分子生物學新技術之一（吳乃虎，2000；）。由于它具有強大的擴增能力,并且可與其它分子生物學方法（如核酸雜交）和免疫學方法（如ELISA）相結合應用,使其敏感性和特異性都大大增強；因而廣泛地應用于生物醫(yī)學領域的各個學科（梁國棟，2001）。靈敏度zui高, 儀器價格昂貴，試驗技術要求高。